Advancing 3D Cell Culture for Biomedical Research Using Primary Cells / Avanzamento della cultura delle cellule 3D per la ricerca biomedica utilizzando le cellule primarie.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

3D Culture Models Mimic the Natural In Vivo Environment

• Cell culture methods are showing great promise in advancing biomedical research, particularly in the fields of drug discovery, cancer biology, and regenerative medicine. These methods typically involve culturing two distinct types of cells in vitro: cell lines and primary cells. Cell lines are populations of cells that have been continually passaged over extended periods of time to evade normal cellular senescence and to acquire homogenous genotypic and phenotypic characteristics (examples include A549, HeLa, and HEK 293 cells). In contrast, primary cells are isolated directly from donor tissue and are non-transformed and non-immortalized.

  Traditional two-dimensional (2D) cell culture methods are increasingly being enhanced by new three-dimensional (3D) technologies that mimic the natural cellular in vivo environment, which is one of the main reasons it is taking off as an experimental approach in biomedical research. Primary cells are also considered to be more biologically representative than cell lines due to their typically identical (or at least similar) characteristics to the original donor tissue.

  Therefore, it is becoming increasingly clear that using primary cells in 3D cell culture can produce more biologically representative models of in vivo multicellular environments compared with using cell lines.Another advantage is that primary cells are more suitable than cell lines for research into personalized therapeutics. Because they remain in a state practically unchanged from that of the original donor tissue, primary cells possess in vitro characteristics that inform targeted therapies more reliably than do cell lines. Primary cells are, therefore, the key to the advancement of 3D cell culture in drug discovery, biomedical research, and precision medicine.

• Cell Lines Are Losing Credibility for Cell Culture

  Cell lines have traditionally been used for cell culture mostly for convenience, because they can be easily handled, are well established, and are relatively inexpensive. In particular, they have been frequently used for high-throughput anticancer drug screening because of their wide availability and the ease with which they can be propagated. However, various concerns are starting to be raised about using cell lines for cell culture.

  First, several biological pathways cannot be represented by cell lines, and we do not have cell lines available to model every type of cancer, which limits the application of cell lines for cancer research.

  Second, cell lines often mutate so that their genotypic and phenotypic characteristics no longer represent those of the original donor cells. For example, Shaw et al. found that in the cell line HEK 293, the properties of the cells had been changed by adenovirus transformation so they more closely resembled immature neurons than embryonic kidney cells.

  Finally, many cell lines are often misidentified and can also be contaminated with other cells. For example, Drexler found that in over 500 reported human leukemia-lymphoma cell lines, 15% were misidentified, and Hughes found that 18–36% of cell lines may be contaminated or misidentified. Cross-contamination of cell lines has persisted as a result of mishandling and a lack of attention to best practices in tissue culture.

  Since cell lines can be contaminated and often have different genotypic and phenotypic characteristics compared to the original donor cells, their use in biomedical research is likely to produce unreliable and inconsistent results that are irreproducible or induce additional studies of questionable value. An open letter prepared by leading cell culture scientists and addressed to Michael O. Leavitt, Secretary of the U.S. Department of Health and Human Services, suggested that as many as 20% of scientific publications using cultured cells might be “blemished” as a result of cross-contamination. In turn, this could cause significant downstream problems. For example, drug screening using cell lines could give false-positive results, leading to increased costs through needless animal testing and clinical trials, and potentially by risking patients’ lives.

  These concerns have resulted in funding agencies and publishers requiring authentication of cell lines for their use in research and in grant applications. For example, in 2015 the U.S. National Institutes of Health revised its guidelines to applications for funding and provided guidelines for reporting and endorsement by major journals. For example, since 2013, the Nature Publishing Group has required authors to report the authentication status of all cell lines used.

• The Advantages of Using Primary Cells for 3D Cell Culture

• Unlike cell lines, primary cells have a limited lifespan, so they maintain identical (or at least, very similar) characteristics to the original donor tissue. Thus, cultures that use primary cells, such as fibroblasts and epithelial cells, can produce more biologically representative models of cells and tissues than cell lines. For this reason, primary cells have applications in cancer biology and for screening anticancer drug candidates.
• Indeed, many cancer research initiatives, such as the Cancer Genome Atlas, prefer to use primary cells rather than cell lines to sequence cancer genomes because they are more biologically relevant. Cultured primary cells that mimic the target tissue are also essential in drug screening, because they can more reliably identify potential drug candidates, and using primary cells reduces the costs associated with downstream animal testing and human clinical trials. Indeed, cytotoxic responses to EC50 doses of the anticancer drug camptothecin have been found to be much different in primary cells compared to cell lines, and primary cell cultures often better mimic the in-vivo tumor response to drugs.
• Culturing some types of primary cells in traditional two-dimensional systems can be difficult, however, particularly if the media composition is not optimal (primary cells, unlike cell lines, typically require additional growth factors in their culture medium). Primary hepatocytes cultured as a monolayer on plastic become undifferentiated and die within just four days. In contrast, they survive for three weeks and maintain differentiation longer when entrapped in a three-dimensional collagen gel matrix. Moreover, primary cells cultured using certain 3D cell culture technologies are showing better success in engineering physiologically relevant cell and tissue models. For example, biomimetic 3D prostate organoids can be generated by culturing human prostate luminal and basal cells and circulating tumor cells in a protein gel matrix to enable the study prostate cancer and facilitate anticancer drug screening. Consequently, primary cells are increasingly becoming the focal point of 3D cell culture in cancer biology.

  In cancer research, many studies on 3D cultures have used established cancer cell lines. However, more recently, using patient-derived primary tumor cells instead of cell lines has generated advanced, more biologically representative 3D models of cancer to aid drug discovery and research.3 For example, one study based on a 3D model of primary human adult lung cancer-associated fibroblasts (LuCAFs) and human bronchial epithelial cells (HBECs) found that LuCAFs alter HBECs by modifying biochemical signals conveyed through the extracellular matrix.A preliminary study by Lonza has also demonstrated that human mammary fibroblasts and human mammary epithelial cells could be successfully co-cultured (using the RAFT™ System) to produce a reliable multicellular model of breast cancer that could be used to conduct anticancer drug screening studies.

  Although using primary cells in 3D cell culture technology has not yet been optimized, it is recognized that its major advantage is the ability to use the same tumor model in vitro and in vivo for cancer research and drug screening. For example, Kondo et al. developed a new method for culturing primary colorectal cancer cells. Using this method, the investigators maintained cell-cell contact throughout the culture process, and they showed that these cultured cells could be used for the evaluation of chemosensitivity and signal pathway activation in cancer cells from individual patients.21 A 3D-tumor model system using primary patient-derived cells could, therefore, promulgate discoveries in cancer research and in early-stage drug discovery for personalized drug programs. 

• Primary Cell Culture: Tips and Tricks

  There are clearly many compelling reasons why primary cells should be used instead of cell lines for research, but their adoption has been gradual because of the widespread belief that they can be difficult to culture. Yet, primary cells are just as easy to culture as cell lines, and simply require adherence to the specific protocols and commercially available growth media kits that are often provided by suppliers. Here are Lonza’s top tips and tricks to ensure the successful culture of primary cells.

  1. Before cells are cultured, they should be prepared correctly. The number of cells that will be needed (and thus the number of flasks) should be calculated beforehand, and the cells should be kept in liquid nitrogen for as long as possible before they are thawed
  2. Cells should be thawed quickly (i.e., in no more than 2 minutes) because they can be harmed if thawing takes longer. Similarly, once the cells are in the medium, they can be temperature sensitive, so repetitive warming and cooling should be avoided.
  3. After culture seeding and cell growth are established, cell proliferation should be stopped once the cells reach 70–80% confluency. Be careful not to reach 100% confluency, as this will make the cells enter senescence.
  4. To dissociate the cells from the culture, cells should be washed with trypsin at room temperature. Because this process can be harsh, the cells should be monitored carefully through a microscope (Versene-assisted detachment is a milder alternative to trypsinization, if required). Afterward, a trypsin neutralizing solution (again at room temperature) should be used to fully inactivate the trypsin.
  5. If contamination is suspected for any reason, the culture should be checked regularly.

• Conclusion

  New three-dimensional cell culture systems are driving forward research in several key biomedical fields, including cancer biology and drug discovery. The cell types available for use in cell culture are either cell lines or primary cells. Increasingly, however, biologically relevant primary cells are becoming the preferred choice because of the various advantages they have over cell lines.

  Specifically, although cell lines are the familiar choice, they require authentication prior to use, are likely to produce unreliable and inconsistent results, and could potentially cause increased costs from failed animal tests and clinical trials in drug development. In contrast, primary cells are showing great promise for biomedical research. For example, they are producing biologically representative 3D models of cancer to aid anticancer drug discovery. As such, using primary cells together with 3D cell culture systems could lead the way in advancing research and drug discovery, potentially helping to combat cancer and other life-threatening diseases.
• ITALIANO
• Modelli di cultura 3D simula l'ambiente naturale in vivo
  I metodi di coltura cellulare stanno mostrando una grande promessa nel far avanzare la ricerca biomedica, in particolare nei settori della scoperta dei farmaci, della biologia del cancro e della medicina rigenerativa. Questi metodi coinvolgono tipicamente la cultura di due distinti tipi di cellule in vitro: linee cellulari e cellule primarie. Le linee cellulari sono popolazioni di cellule che hanno continuamente trascorso lunghi periodi di tempo per eludere la senescenza cellulare normale e per acquisire caratteristiche omogenee genotipiche e fenotipiche (esempi includono le cellule A549, HeLa e HEK 293). Al contrario, le cellule primarie sono isolate direttamente dal tessuto donatore e non sono nè trasformate e nè immortalizzate.
  Le metodologie tradizionali bidimensionali (2D) della coltura cellulare sono sempre più potenziate da nuove tecnologie tridimensionali (3D) che simulano l'ambiente cellulare in vivo naturale, uno dei motivi principali per cui sta prendendo come approccio sperimentale nella ricerca biomedica . Le cellule primarie sono anche considerate più biologicamente rappresentative delle linee cellulari a causa delle loro caratteristiche tipicamente identiche (o almeno simili) rispetto al tessuto originale del donatore.
  Pertanto, sta diventando sempre più chiaro che l'utilizzo di cellule primarie nelle colture cellulari 3D può produrre più modelli biologicamente rappresentativi di ambienti multicellulari in vivo rispetto all'uso delle linee cellulari. Un altro vantaggio è che le cellule primarie sono più adatte alle linee cellulari per la ricerca di terapie personalizzate. Poiché rimangono in uno stato praticamente invariato rispetto a quello del tessuto originale del donatore, le cellule primarie possiedono caratteristiche in vitro che informano le terapie mirate in modo più affidabile rispetto alle linee cellulari. Le cellule primarie sono quindi la chiave per il progresso della coltura delle cellule 3D nella scoperta di farmaci, ricerca biomedica e medicina di precisione.
  Le linee cellulari stanno perdendo credibilità per la cultura cellulare
  Le linee cellulari sono state tradizionalmente utilizzate per la coltura cellulare principalmente per comodità, perché possono essere facilmente gestite, sono ben consolidate e sono relativamente poco costose. In particolare, esse sono state spesso utilizzate per screening di farmaci anticancro ad alta percentuale a causa della loro ampia disponibilità e della facilità con cui possono essere propagate. Tuttavia, varie preoccupazioni stanno iniziando ad essere sollevate circa l'uso di linee cellulari per la cultura cellulare.
  In primo luogo, diversi percorsi biologici non possono essere rappresentati da linee cellulari e non abbiamo linee cellulari disponibili per modellare ogni tipo di cancro, che limita l'applicazione di linee cellulari per la ricerca sul cancro.
  In secondo luogo, le linee cellulari spesso mutano in modo che le loro caratteristiche genotipiche e fenotipiche non rappresentino più le cellule donatrici originali. Ad esempio, Shaw et al. Ha rilevato che nella linea cellulare HEK 293, le proprietà delle cellule erano state modificate dalla trasformazione adenovirus in modo che avevano più somiglianza ai neuroni immaturi rispetto alle cellule renali embrionali.
  Infine, molte linee cellulari sono spesso non benedentificate e possono anche essere contaminate con altre cellule. Per esempio, Drexler ha scoperto che in oltre 500 linfonodi umani di linfoma-leucemia umana, il 15% è stato erroneamente identificato e Hughes ha scoperto che il 18-36% delle linee cellulari può essere contaminato o non bene dentificato. La contaminazione incrociata delle linee cellulari è persistita a causa della mancata gestione e della mancanza di attenzione alle migliori pratiche nella coltura tissutale.
  Poiché le linee cellulari possono essere contaminate e spesso presentano caratteristiche genotipiche e fenotipiche diverse rispetto alle cellule donatrici originali, il loro impiego nella ricerca biomedica è probabile che produca risultati non affidabili e incoerenti che siano non rproducibili o inducano ulteriori studi di valore discutibile. Una lettera aperta preparata dai principali scienziati della cultura delle cellule e indirizzata a Michael O. Leavitt, segretario del Dipartimento di Salute e Servizi Umani degli Stati Uniti, ha suggerito che fino al 20% delle pubblicazioni scientifiche che utilizzano cellule coltivate potrebbero essere "sconfinate" a seguito di contaminazione incrociata. A sua volta, ciò potrebbe causare problemi significativi a valle. Ad esempio, lo screening di farmaci che utilizza linee cellulari potrebbe dare risultati falsi positivi, portando ad aumentare i costi attraverso prove animali inutili e sperimentazioni cliniche e potenzialmente rischiando la vita dei pazienti.
  Queste preoccupazioni hanno portato allo sviluppo di  agenzie e publisher di finanziamento che richiedono l'autenticazione delle linee cellulari per il loro utilizzo nella ricerca e nelle domande di sovvenzione. Ad esempio, nel 2015 gli Istituti Nazionali di Salute degli Stati Uniti hanno rivisto le proprie linee guida alle domande di finanziamento e hanno fornito linee guida per la segnalazione e l'approvazione delle principali riviste. Ad esempio, dal 2013, il gruppo di pubblicazione Nature ha richiesto agli autori di segnalare lo stato di autenticazione di tutte le linee cellulari utilizzate.
• I vantaggi di utilizzare le cellule primarie per la cultura delle cellule 3D
  A differenza delle linee cellulari, le cellule primarie hanno una durata di vita limitata, pertanto mantengono caratteristiche identiche (o almeno molto simili) al tessuto originale del donatore. Così, le colture che utilizzano cellule primarie, come i fibroblasti e le cellule epiteliali, possono produrre più modelli biologicamente rappresentativi di cellule e tessuti rispetto alle linee cellulari. Per questo motivo, le cellule primarie hanno applicazioni nella biologia del cancro e per la selezione di candidati anticancro.
  Infatti, molte iniziative di ricerca sul cancro, come il Cancer Genome Atlas, preferiscono utilizzare celle primarie piuttosto che linee cellulari per sequenziare i genomi del cancro perché sono più biologicamente rilevanti. Le cellule primarie coltivate che imitano il tessuto bersaglio sono inoltre essenziali nello screening dei farmaci, in quanto possono identificare più affidabilmente i candidati potenziali di farmaci e utilizzando le cellule primarie riducono i costi associati ai test a valle e agli studi clinici umani. Infatti, le risposte citotossiche alle dosi EC50 del farmaco anticancro della camptothecin  sono state trovate molto diverse nelle cellule primarie rispetto alle linee cellulari e le colture cellulari primarie spesso meglio imitano la risposta tumorale in vivo ai farmaci.
  La cultura di alcuni tipi di cellule primarie nei sistemi bidimensionali tradizionali può essere difficile, tuttavia, in particolare se la composizione dei mezzi non è ottimale (le cellule primarie, a differenza delle linee cellulari, richiedono tipicamente fattori di crescita supplementari nel loro mezzo di coltura). Gli epatociti primari coltivati ​​come monostrato sulla plastica diventano indifferenziati e muoiono entro quattro giorni. Al contrario, sopravvivono per tre settimane e mantengono la differenziazione più a lungo quando entra in una matrice tridimensionale del gel di collagene. Inoltre, le cellule primarie coltivate usando determinate tecnologie di coltura delle cellule 3D stanno mostrando un miglior successo nell'innovazione di modelli fisiologicamente rilevanti di cellule e tessuti. Ad esempio, organoidi della prostata biomimetica 3D possono essere generati coltivando cellule luminescenti e basali della prostata umana e cellule tumorali circolanti in una matrice di gel di proteine ​​per consentire lo studio del cancro della prostata e facilitare lo screening dei farmaci antitumorali. Di conseguenza, le cellule primarie stanno diventando sempre più il punto focale della cultura delle cellule 3D nella biologia del cancro.
  Nella ricerca sul cancro, molti studi sulle culture 3D hanno utilizzato linee di cellule tumorali consolidate. Tuttavia, più di recente, utilizzando cellule tumorali primarie derivate dal paziente anziché linee cellulari, hanno generato modelli avanzati e più rappresentativi biologici del cancro per favorire la ricerca e la ricerca di farmaci. Ad esempio, in uno studio basato su un modello 3D del polmone primario dell'uomo adulto i fibroblasti associati al cancro (LuCAF) e le cellule epiteliali bronchiali umane (HBECs) hanno scoperto che i LuCAF alterano HBECs modificando i segnali biochimici trasmessi attraverso la matrice extracellulare. Uno studio preliminare di Lonza ha anche dimostrato che i fibroblasti mammari umani e le cellule epiteliali umane mammarie Co-coltivati ​​(utilizzando il sistema RAFT ™) per produrre un modello multicellulare affidabile di cancro al seno che potrebbe essere utilizzato per condurre studi di screening dei farmaci antitumorali.
  Sebbene l'utilizzo di cellule primarie nella tecnologia delle colture cellulari 3D non sia stato ancora ottimizzato, è riconosciuto che il suo principale vantaggio è la capacità di utilizzare lo stesso modello tumorale in vitro e in vivo per la ricerca sul cancro e la selezione dei farmaci. Ad esempio, Kondo ha sviluppato un nuovo metodo per la coltura di cellule primarie di cancro del colon-retto. Utilizzando questo metodo, i ricercatori hanno mantenuto il contatto delle cellule cellulari in tutto il processo di coltura e hanno dimostrato che queste cellule coltivate potrebbero essere utilizzate per la valutazione della sensibilità chimica e dell'attivazione del percorso dei segnali nelle cellule tumorali da singoli pazienti. In  modello di cellule tumorali 3D,  le cellule primarie derivate dal paziente potrebbero pertanto promulgare scoperte nella ricerca sul cancro e nella scoperta di farmaci da parte dei pazienti per programmi personalizzati di uso di farmaci.
  Cultura delle cellule primarie: suggerimenti e trucchi
  Ci sono chiaramente molti motivi convincenti per utilizzare le cellule primarie invece delle linee cellulari per la ricerca, ma la loro adozione è stata graduale a causa della diffusa convinzione che possono essere difficili da coltivare. Tuttavia, le cellule primarie sono altrettanto facili da coltivare come le linee cellulari e richiedono semplicemente l'adesione ai protocolli specifici e ai kit di supporto per la crescita che sono spesso forniti dai fornitori. Ecco i suggerimenti ed i trucchi migliori di Lonza per assicurare la cultura di successo delle celle primarie.
  
  
  Prima che le cellule siano coltivate, dovrebbero essere preparate correttamente. Il numero di celle necessarie (e quindi il numero di palloni) deve essere calcolato in anticipo e le celle dovrebbero essere tenute in azoto liquido per il più tempo possibile prima di essere scongelate
  Le cellule devono essere scongelate rapidamente (cioè in soli 2 minuti) perché potrebbero essere danneggiate se la scongelazione richiede più tempo. Allo stesso modo, una volta che le cellule sono nel mezzo, possono essere sensibili alla temperatura, in modo da evitare il riscaldamento e il raffreddamento ripetitivo.
• Dopo la coltivazione della coltura e la crescita cellulare, la proliferazione cellulare dovrebbe essere interrotta una volta che le cellule raggiungono la confluenza del 70-80%. Fare attenzione a non raggiungere la confluenza del 100%, poiché questo attiverà le cellule ad entrare in senescenza.
  Per dissociare le cellule dalla coltura, le cellule devono essere lavate con trypsina a temperatura ambiente. Poiché questo processo può essere impegnaticvo, le celle dovrebbero essere monitorate attentamente attraverso un microscopio (il distacco a Versene è un'alternativa più lieve alla tripossinizzazione, se necessario). Successivamente, una soluzione neutralizzante della tripsina (ancora a temperatura ambiente) deve essere utilizzata per inattivare completamente la tripsina.
  Se la contaminazione è sospetta per qualsiasi motivo, la coltura deve essere controllata regolarmente.
  Conclusione
  Nuovi sistemi tridimensionali di colture cellulari stanno portando avanti la ricerca in diversi campi biomedici chiave, tra cui la biologia del cancro e la scoperta di farmaci. I tipi di cellule disponibili per l'uso nella coltura cellulare sono linee cellulari o cellule primarie. Sempre più, tuttavia, le cellule primarie biologicamente rilevanti stanno diventando la scelta preferita a causa dei vari vantaggi che hanno sulle linee cellulari.
  In particolare, sebbene le linee cellulari siano la scelta familiare, richiedono l'autenticazione prima dell'uso, in quanto potrebbero produrre risultati non affidabili e incoerenti e potenzialmente potrebbero causare un aumento dei costi da prove sperimentali fallite e sperimentazioni cliniche nello sviluppo di farmaci. Al contrario, le cellule primarie stanno mostrando grande promessa per la ricerca biomedica. Ad esempio, producono modelli 3D biologicamente rappresentativi del cancro per aiutare la scoperta di farmaci antitumorali. In quanto tale, utilizzando le cellule primarie insieme a sistemi di coltura delle cellule 3D potrebbe portare avanti la ricerca di farmaci, potenzialmente aiutando a combattere il cancro e altre malattie mortali.
• Da:
• http://www.genengnews.com/gen-articles/advancing-3d-cell-culture-for-biomedical-research-using-primary-cells/6094

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