Crio-Microscopia Elettronica: uno sguardo verso l'infinito. Cryo-Electronic Microscopy: A Look At The Infinity.

Crio-Microscopia Elettronica: uno sguardo verso l'infinito. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questa applicazione.Cryo-Electronic Microscopy: A Look At The Infinity. The process of the ENEA RM2012A000637 patent is very useful in this application.



Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa





Avete presente quando avete acceso per la prima volta il vostro nuovo televisore ad alta definizione, dopo esservi sbarazzati del vecchio tubo catodico? Che meraviglia e che dettagli mai apprezzati prima!
Chi l’avrebbe mai detto che il tatuaggio sull’avambraccio di Kobe Bryant dicesse: “I love Science”? Il paragone tra un vecchio televisore e l’alta definizione è utile per dare un’idea di quello che sta veramente succedendo nel campo della Crio-Microscopia Elettronica – in breve Cryo-EM, – una tecnica per fotografare l’infinitamente piccolo.

La Cryo-EM di per se non è nulla di nuovo. La tecnica consiste nel congelare rapidamente un campione biologico da visualizzare per poterlo immobilizzare e bombardare di elettroni. Questi rimbalzano sul campione e poi vengono catturati da un sensore che ne restituisce l’immagine. Il congelamento rapido è un modo per preservare una struttura biologica senza che si formino cristalli di ghiaccio che la danneggino (in gergo il processo si chiama ‘vetrificazione’) e il  “bombardamento di elettroni” è alla base della microscopia elettronica, una tecnica quasi centenaria che si usa per visualizzare cellule intere o anche tessuti. Il loro matrimonio è avvenuto già negli anni ’80 al Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare (EMBL) di Heidelberg. Fino a qualche anno fa, il risultato di tutta questa complicazione era un’immagine simile a quella di un televisore di inizio secolo: sfuocata, sgranata, insomma un blob di difficile interpretazione.
Ma due cose sono radicalmente cambiate negli ultimi anni per darci una sorta di versione 2.0 della Cryo-EM. Una è l’hardware: i sensori che raccolgono gli elettroni, come per le macchine fotografiche, sono diventati incredibilmente più sensibili e piu’ veloci. La seconda è il software: i programmi che interpretano le immagini sono infinitamente più intelligenti e precisi a distinguere il segnale dal rumore di fondo. La combinazione di questi miglioramenti incrementali ha portato ad un salto qualitativo enorme a livello di quello che può essere visualizzato e della risoluzione, che ora è a livello di pochi Angstrom, un’unita di misura dell’infinitamente piccolo che corrisponde piu o meno alla dimensione degli atomi. Si è passati quindi da un blob, al vedere la forma dettagliata dei singoli amino-acidi, i mattoncini che compongono le proteine. Più o meno come scoprirsi rapiti dalla delicata cesellatura di una scultura, quando fino a poco tempo fa si poteva guardare solo il blocco di marmo sgrossato, prima che fosse scolpito.
Fino ad ora, per poter vedere le proteine a una tale definizione si doveva cristallizzarle, ovvero costringerle a organizzarsi come in un grano di sale e poi si doveva investirle con dei raggi X, ancora più potenti degli elettroni, generati da un sincrotrone. Questo metodo, chiamato “Cristallografia a raggi X” ci ha dato le prime strutture delle proteine come quella che fece vincere il Nobel a John Kendrew e Max Perutz nel 1962 e si usa tutt’ora con grande successo. Ha però il difetto che non sempre le proteine formano un cristallo, in particolare se sono troppo grandi, hanno forma irregolare o parti mobili o se sono inserite in una membrana.
La Cryo-EM versione 2.0 invece non ha nessuno di questi limiti. La corsa all’oro che ha scatenato negli ultimi due anni è impressionante e ci ha portato al vedere ad una definizione quasi-atomica un gran numero di complessi di proteine, aprendo scenari inimmaginabili. Un primo esempio è la struttura di un enzima batterico relativamente piccolo chiamato Beta-Galattosidasi.
Nel 2014 la nuova Cryo-EM ci ha permesso di guardarla a 3,2 Angstrom. L’anno scorso gli stessi autori si sono migliorati e sono scesi a 2,2 Angstrom, dimostrando che Cryo-EM compete con la Cristallografia a raggi X a livello di risoluzione.
L’alta risoluzione ora permette anche di generare immagini in cui visualizzare l’organizzazione spaziale di strutture cristallografiche già note all’interno di complessi composti da più proteine, come in un gigantesco puzzle 3D. È notizia recente la pubblicazione su Science della struttura della parte interna dei pori nucleari che non c’entrano con la pelle tatuata di Bryant, ma che invece regolano gli scambi tra il nucleo e il citoplasma delle nostre cellule.

The architecture of the nuclear pore. The outer ring is colored in orange and blue, whereas the newly characterized inner ring is seen in green and lemon. Credit: Jan Kosinski/EMBL L'architettura del poro nucleare. L'anello esterno è colorato in arancione e blu, mentre l'anello interno recentemente caratterizzato è visto in verde e nel limone.
Al di là delle ovvie ricadute per la biologia di base, quest’approccio applicato a proteine di interesse medico permetterà un salto di qualità nella nostra capacità di inventare nuovi vaccini e farmaci. Un esempio appropriato è la gamma-secretasi che, se mutata, causa l’Alzheimer. E’ in gran parte nascosta all’interno delle membrane cellulari, quindi negli anni ha resistito a molti tentativi di essere visualizzata. Alla fine, ce l’hanno fatta proprio per Cryo-EM un paio di anni fa. Un altro esempio è la recentissima struttura dell’involucro del virus Zikapubblicata su Nature. In entrambi i casi, ora le vediamo talmente bene che la speranza è di poter disegnare farmaci che possano aderire esattamente alle loro forme.
Gli avanzamenti radicali del Cryo-EM portano con sé ovviamente anche dei limiti. I nuovi microscopi sono costosissimi, nell’ordine di parecchie milioni di euro, e generano quantità spaventose di dati. A tal punto che la comunità dei biologi strutturali sta richiedendo a gran voce la costruzione di centri condivisi dove poter acquisire le immagini e analizzare i dati. Inoltre, i nuovi algoritmi che ripuliscono i segnali dal rumore di fondo utilizzano una serie di modelli teorici che non trovano ancora un consenso assoluto e alcuni ricercatori temono che a volte introducano degli artefatti.
Nonostante i limiti di cui sopra, la rivoluzione è in corso e non passerà in televisione, parafrasando una vecchia canzone. A giudicare però dai recenti avanzamenti di altre tecniche di microscopia, la rivoluzione non sarà neanche limitata alla Cryo-EM. Infatti, miglioramenti incredibili si registrano anche nella microscopia ottica, che per guardare non usa elettroni o raggi X, ma normali fasci di luce. Pensate che con i nuovi sistemi di microscopia confocale a super-risoluzione si è riusciti a superare il limite massimo di risoluzione ottica, teorizzato dal fisico tedesco Ernst Abbe nel 1873.
In generale, è chiaro che riusciremo sempre più a guardare anche laddove prima non si poteva. Tutti questi miglioramenti ci permetteranno senza dubbio di eliminare molte zone d’ombra del nostro sapere. Il nuovo limite, comune a tutta la scienza moderna dei Big Data, sarà la nostra capacità di interpretare e comprendere, quindi non di guardare, ma di vedere. Siamo ben oltre San Tommaso, che non credeva a cio’ che non vedeva. Ora vediamo e tocca decidere a cosa credere.
ENGLISH
Do you notice when you first turned on your new high definition television after getting rid of the old cathode tube? What a wonderful and what details did you ever appreciate before!
Who would have ever said that the tattoo on Kobe Bryant's forearm said: "I love Science"? The comparison between an old television and high definition is useful to give an idea of what is really happening in the Cryo-Electronic Microscopy - in short Cryo-EM - a technique for infinitely small photography.
The Cryo-EM is nothing new. The technique is to quickly freeze a biological sample to be displayed in order to immobilize and bombard electrons. They bounce on the sample and then captured by a sensor that returns the image. Fast freezing is a way to preserve a biological structure without forming ice crystals that damage it (the process is called 'vitrification') and "electron bombing" is the basis of electronic microscopy, a nearly centenary technique Which is used to display whole cells or even tissues. Their marriage took place in the 80s at Heidelberg's European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Until a few years ago, the result of all this complication was a picture similar to that of a television of the beginning of the century: blurred, grainy, in short, a blob of difficult interpretation.
But two things have radically changed over the last few years to give us some sort of version 2.0 of the Cryo-EM. One is hardware: sensors that collect electrons, as with cameras, have become incredibly more sensitive and faster. The second is the software: the programs that interpret the images are infinitely more intelligent and precise to distinguish the signal from the background noise. The combination of these incremental improvements has led to a huge leap in the level of what can be displayed and the resolution, which is now at the level of a few Angstrom, an infinitely small measurement unit that is more or less the size of atoms. You then went through a blob, seeing the detailed form of the individual amino acids, the bricks that make up the proteins. More or less as to get caught up in the delicate carving of a sculpture, when until recently you could only look at the rough marble block before it was carved.
Until now, in order to see the proteins at such a definition, it was necessary to crystallize them, or to force them to organize themselves as in a salt grain, and then to invest them with more powerful electron-generated X-rays generated by a synchrotron. This method, called "X-ray Crystallography", gave us the first protein structures that won the Nobel Prize at John Kendrew and Max Perutz in 1962 and is still used today with great success. However, it has the defect that proteins do not always form a crystal, especially if they are too large, have an irregular shape or moving parts or if they are inserted into a membrane.
Cryo-EM version 2.0 does not have any of these limits. The gold race that has sparked in the last two years is impressive and has led us to see a large number of protein complexes at a quasi-atomic definition, opening unimaginable scenarios. A first example is the structure of a relatively small bacterial enzyme called Beta-Galactosidase.
In 2014, the new Cryo-EM allowed us to look at it at 3.2 Angstrom. Last year, the same authors improved and dropped to 2.2 Angstrom, demonstrating that Cryo-EM competes with X-ray Crystallography at resolution level.
The high resolution now also allows generating images in which to visualize the spatial organization of crystallographic structures already known within complexes of multiple proteins, as in a gigantic 3D puzzle. There is a recent announcement of the publication of the internal structure of the nuclear pores of Science that does not affect Bryant's tattooed skin, but which regulates the exchange between the nucleus and the cytoplasm of our cells.
Beyond the obvious implications for basic biology, this approach applied to proteins of medical interest will allow a leap in quality in our ability to invent new vaccines and drugs. An appropriate example is the gamma-secretase that, if changed, causes Alzheimer's. It's largely hidden inside the cell membranes, so over the years, it has resisted many attempts to be displayed. In the end, they did it just for Cryo-EM a couple of years ago. Another example is the recent structure of the Zika virus wrap, published by Nature. In both cases, we now see them so well that the hope is to draw drugs that can fit exactly on their shapes.
Cryo-EM's radical advancements, of course, also carry limits. The new microscopes are expensive, in the order of several million euros, and generate frightening amounts of data. To the point that the community of structural biologists is loudly calling for the construction of shared centers where they can capture images and analyze data. In addition, new algorithms that clean up a signal from background noise use a number of theoretical models that do not yet have absolute consensus and some researchers fear that they sometimes introduce artifacts.
Despite the above limits, the revolution is under way and will not go on television, paraphrasing an old song. Judging by the recent advances in other microscopic techniques, the revolution will not be limited to Cryo-EM. In fact, incredible improvements are also recorded in optical microscopy, which for viewing does not use electrons or X-rays, but normal beams of light. You think that with the new super-resolution confocal microscopy systems you managed to overcome the maximum optical resolution limit, theorized by the German physicist Ernst Abbe in 1873.
In general, it is clear that we will be able to watch more and more as you could not. All these improvements will allow us to undo many shadow areas of our knowledge. The new limit, common to all the modern science of Big Data, will be our ability to interpret and understand, so not to look but to see. We are far beyond Saint Thomas, who did not believe what he did not see. Now let's see and decide what to believe.
Da:http://www.rivistamicron.it/temi/crio-microscopia-elettronica-uno-sguardo-verso-linfinito/

Commenti

Post popolari in questo blog

Paracetamolo, ibuprofene o novalgina: quali le differenze? / acetaminophen, ibuprofen, metamizole : what are the differences?

Diminuire l'ossigeno per aumentare la longevità? / Decrease Oxygen to Boost Longevity?

Sci-Fi Eye: il nostro futuro urbano / Sci-Fi Eye: Our Urban Future