Approfondimento sulle cellule staminali / Stem cell research

Approfondimento sulle cellule staminali / Stem cell research

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Le cellule staminali sono cellule caratterizzate da tre importanti caratteristiche:

1. Sono cellule indifferenziate
2. Sono capaci di autorinnovarsi (questa attività è detta “self renewal”) per molti cicli di divisione cellulare rimanendo in indifferenziate
3. Virtualmente possono differenziarsi nelle cellule di ogni tessuto od organo

Sulla base della capacità differenziativa possiamo distinguere le cellule staminali in: 

1. Cellule staminali totipotenti:

   le cellule staminali appartenenti a questo gruppo si dividono producendo tutti i tipi cellulari di un organismo. Lo sviluppo umano, ad esempio, inizia al momento della fecondazione con la formazione di una singola cellula totipotente, lo zigote.

2. Cellule staminali pluripotenti:

   sono cellule staminali che hanno la possibilità di differenziarsi in cellule di uno qualsiasi dei tre foglietti embrionali (endoderma, mesoderma, ectoderma). Il differenziamento di cellule pluripotenti non porta però alla formazione di cellule capaci di formare tessuti extraembrionali, come ad esempio la placenta. Questa possibilità rimane esclusiva delle cellule staminali totipotenti.

3. Cellule multipotenti:

   queste cellule possono dare origine a diversi tipi cellulari, ma limitati ad uno specifico lineaggio. Ad esempio, le cellule ematopoietiche possono differenziarsi solamente in cellule del sangue e non in cellule cerebrali.
   
   
4.  Cellule unipotenti:

queste possono dividersi e sviluppare un solo tipo di tessuto/cellula. Sono comunque considerate staminali poichè mantengono la capacità di self renewal.

Cellule progenitrici endoteliali non sono rilevabili in sangue periferico e cordone sano

Cellule endoteliali circolanti (CEC) e loro progenitori (EPC) sono limitate sottopopolazioni cellulari del sangue periferico (PB), del sangue del cordone (CB), e del midollo osseo (BM). Tali cellule sono coinvolte nel mantenimento dell'omeostasi endoteliale. Sia CEC che EPC si crede possano essere potenziali biomarcatori in diverse condizioni cliniche che coinvolgono il rimodellamento endoteliale. Ad oggi sono già stati pubblicati diversi metodi per la caratterizzazione di CEC e EPC tramite citometria a flusso, ma nessuno di questi ha raggiunto conclusioni coerenti; di conseguenza le linee guida per un utilizzo in clinica devono essere ancora stabilite. 

Paola Lanuti e colleghi hanno effettuato uno studio approfondito del fenotipo di CEC e di EPC in campioni di PB, CB e BM sani, ottimizzando un pannello di citometria di flusso policromatico (PFC) affidabile. 

I risultati hanno mostrato che l' espressione CD34 sulle cellule circolanti in PB e CB sani, rappresenta un punto di riferimento fondamentale per l'identificazione dei CEC (CD45neg / CD34bright / CD146pos) rispetto a cellule staminali ematopoietiche (CD45dim / CD34pos / CD146neg). Questo approccio, combinato con una tecnica di conteggio a doppia-piattaforma, ha permesso una enumerazione CEC in PB sano  (n = 38), e conseguente conta CEC in linea con i dati precedentemente riportati (mediana = 11,7 cellule / ml). 

In parallelo, utilizzando rigorose impostazioni in PFC ( selezione di cellule CD34pos / CD45dim / CD133pos / VEGFR2pos) è risultato che l'antigene EPC non sono stato trovato in nessun campione di PB o CB sano analizzato, in quanto l'espressione di VEGFR2 non è stato rilevabile sulla superficie delle cellule CD34pos / CD45dim / CD133pos. 

Nel complesso, i risultati suggeriscono che il profilo dell'antigene EPC precedentemente riportato, definito dall'espressione simultanea di VEGFR2 e CD133 sulla superficie delle cellule CD45dim / CD34pos, deve essere attentamente rivalutato e ulteriori studi dovrebbero essere condotti per ridefinire le caratteristiche EPC per tradurre CEC e caratterizzazione EPC nella pratica clinica.

cellule staminali del cordone ombelicale

Il cordone ombelicale contiene mediamente 60-80 cc di sangue ed in questo si trovano le cellule staminali. 

Recenti evidenze scientifiche dimostrano che è possibile crioconservare le cellule staminali del cordone ombelicale per almeno 24 anni senza alterarne la vitalità. 

Questo implica che cellule staminali cordonali raccolte più di 20 anni fa possono essere efficacemente trapiantate. In ragione di questo risulta essere più che corretto pensare al cordone ombelicale come un organo prezioso anche dopo 20 anni.

Le cellule staminali del cordone ombelicale mostrano una peculiare “immaturità” immunologica, dovuta alla bassa espressione sulla superficie cellulare di antigeni appartenenti al sistema maggiore di istocompatibilità (MHC I) ed alla totale assenza di espressione di antigeni (e molecole costimolatorie) associati all’MHC di tipo II. 

Grazie a queste proprietà, il trapianto allogenico di cellule staminali cordonali ha una maggiore probabilità di attecchire ed un minor rischio di rigetto. 

Il rischio di rigetto è inoltre ridotto grazie alla presenza nel sangue cordonale di cellule T regolatorie che sono capaci di prevenire o curare condizioni infiammatorie e modulare le risposte immunitarie deprimendo l’attività dei linfociti T autoreattivi.

Infine le cellule staminali del cordone ombelicale sono in grado di svolgere un’azione anti infiammatoria; possono infatti “spegnere” reazioni infiammatorie grazie alla loro capacità di rilasciare diversi fattori solubili come prostaglandina E2 ed interleuchina 6.

La popolazione di cellule staminali del cordone ombelicale consta di diversi sottotipi cellulari: (i) cellule staminali cordonali simil-embrionali, capaci di differenziare verso tessuti endodermici (ad esempio polmone), mesodermici (come il cuore) ed ectodermici (ad esempio il sistema nervoso); (ii) cellule staminali cordonali mesenchimali, in grado di originare tessuto cartilagineo, adiposo, osseo, cellule nervose e mesoderma viscerale; (iii) cellule staminali cordonali ematopoietiche, capaci di specializzarsi in cellule del midollo osseo e del sangue; (iv) cellule staminali cordonali endoteliali, in grado di formare vasi sanguigni (1). Le cellule staminali mesenchimali (CB-MSCs) sono cellule multipotenti a struttura fibroblastoide dotate di una elevata capacità di autorinnovarsi con un alto potenziale di proliferazione e di differenziazione. In vitro possono essere sottoposte a numerosi cicli replicativi e sono in grado sia di originare colonie CFU-F sia di aderire alle superfici plastiche (2). La caratterizzazione dell’immunofenotipo delle CB-MSCs ha permesso di identificarne (i) la positività verso markers superficiali quali: CD105, CD73, CD106, CD54, CD44, CD90, CD29, STRO-1e (ii) la negatività per i markers CD14, CD34, CD45. In aggiunta le CB-MSCs esprimono importanti molecole e fattori di trascrizione quali SMA vimentin, nestin, desmin, Ki-67, Oct-4, NANOG, SSEA-4. In modelli preclinici, è stata valutata la capacità delle CB-MSCs di dare origine a cellule producenti insulina  (IPCs). Uno studio condotto da  Gao et al., ha dimostrato che CB-MSCs, quando coltivate in un medium contenente alte concentrazioni di glucosio, nicotinamide, acido retinoico, exendina-4 e fattore di crescita epidermico, differenziano verso IPCs in grado sia di esprimere markers tipicamente pancreatici (come PDX-1, Pax- 4, Glut-2 and Ngn-3), sia di produrre de novo  insulina. IPCs derivanti da CB-MSCs trapiantate sotto la capsula renale in un modello murino, hanno dato luogo ad un aumento dei livelli serici di insulina, senza tuttavia migliorare il controllo glicometabolico. La capacità delle CB-MSCs di differenziare in tessuto osseo è stata indagata in un studi sperimentali al fine di sviluppare nuovi protocolli terapeutici in ambito ortopedico. Infine l’attività immunomodulatoria esercitata dalle CB-MSCs rappresenta un potenziale strumento nel controllo della “malattia del trapianto contro l’ospite” (GVHD). Per questo motivo la capacità delle CB-MSCs di prevenire e trattare la GVHD è stata studiata in topi NOD/SCID i quali, dopo essere stati sottoposti ad infusione di cellule mononucleate umane da sangue periferico, hanno esibito segni di GVHD, come ad esempio una massiccia presenza di linfociti T umani nei linfonodi, nel fegato e nei polmoni. La somministrazione multipla e sistemica di CB-MSCs nei topi NOD/SCID ha ridotto significativamente la  proliferazione delle cellule T umane ed il danno ai tessuti, migliorando, di conseguenza, il tasso di sopravvivenza degli animali trattati. Al contrario, nessun effetto terapeutico è stato rilevato a seguito di infusione di CB-MSCs alla comparsa di GVHD. Ne consegue quindi che l’utilizzo clinico di CB-MSCS rappresenta quindi un trattamento profilattico nella prevenzione della GVHD

I vantaggi offerti dalle cellule staminali del cordone ombelicale

- Possono essere prelevate senza esporre il donatore ad alcun rischio procedurale o infettivo, situazione che invece si manifesta durante la raccolta di cellule dal midollo osseo - Hanno un potenziale rigenerativo maggior rispetto a cellule staminali adulte - Mostrano una maggiore stabilità cromosomica, cioè hanno un DNA meno prono alle mutazioni, rispetto le cellule staminali adulte - Hanno una minor potenzialità oncogenica, cioè di formare tumori, rispetto alle cellule staminali adulte - Sono cellule immunologicamente immature, il che le rende più accettabili dall’organismo minimizzando l’insorgenza di patologie post trapianto, come ad esempio la Graft Versus Host Disease (GVHD) - Sono cellule in grado di esercitare azione anti infiammatoria

- Il connubio tra capacità immunomodulatorie ed anti-infiammatorie fa delle cellule staminali cordonali ad uso autologo un ottimo strumento per la cura delle malattie autoimmuni - La loro raccolta ed utilizzo non suscita alcun problema di natura etica, situazione che invece si presenta in relazione alle cellule staminali embrionali Perchè conservare le cellule staminali del cordone ombelicale Diversi sono i motivi per cui è consigliabile conservare le cellule staminali del cordone ombelicale. Innanzitutto tali cellule sono già state utilizzate come trattamento per diverse patologie come ad esempio leucemie, linfomi, anemie (il primo trapianto di staminali cordonali venne eseguito su di un paziente affetto da anemia di Fanconi). In aggiunta, i continui progressi della ricerca scientifica stanno ampliando sempre più il range di potenziale applicazione terapeutica delle cellule staminali estratte dal cordone ombelicale; ad esempio sono in già in corso trials clinici per valutare l’efficacia, nell’uomo, del trapianto di cellule staminali del cordone ombelicale nella cura del diabete. Come avviene la conservazione delle cellule staminali cordonali Al momento della nascita, il sangue cordonale viene raccolto dalla vena ombelicale e trasferito in una apposita sacca di raccolta contenente un anticoagulante (normalmente una soluzione citrato-fosfato-destrosio). Dopo la raccolta, il sangue cordonale viene sottoposto ad analisi ematologiche valutandone: la cellularità, il volume, la presenza di batteri ed altri parametri. Successivamente i globuli rossi ed il plasma vengono eliminati, mantenendo la sola frazione di cellule mononucleate (cioè le cellule staminali del cordone ombelicale). L’unità ottenuta viene successivamente miscelata con dimetilsolfossido al 10% e trasferita in una sacca deputata alla crioconservazione. Quest'ultima, infine, viene posta in appositi congelatori a diminuzione controllata della temperatura e crioconservata in vapori di azoto a -196°C. É stato scientificamente dimostrato che le cellule staminali del cordone ombelicale possono essere crioconservate fino a 24 anni senza alterarne la vitalità la proliferazione e la capacità differenziativa.  ENGLISH Stem cells are cells characterized by three important characteristics: They are undifferentiated cells They are capable of self-renewal (this activity is called "self-renewal") for many cell division cycles remaining undifferentiated Virtually they can differentiate into the cells of each tissue or organ Based on the differentiation capacity we can distinguish stem cells in: Totipotent Stem Cells: stem cells belonging to this group are divided by producing all cell types of an organism. Human development, for example, begins at the time of fertilization with the formation of a single totipotent cell, the zygote. Pluripotent Stem Cells: are stem cells that have the potential to differentiate into cells of any of the three embryonic leaves (endoderm, mesoderm, ectoderm). The differentiation of pluripotent cells does not, however, result in the formation of cells capable of forming extra-embryonal tissues, such as placenta. This possibility remains exclusive to totipotent stem cells. Multipotent Cells: these cells can give rise to different cell types, but limited to a specific lineage. For example, hematopoietic cells may differ only in blood cells and not in brain cells.  Unipotent Cells: these can divide and develop only one type of tissue/cell. However, they are considered stem cells as they retain the ability to self-renewal. Endothelial progenitor cells are not detectable in peripheral blood and healthy cordon Circulatory Endothelial Cells (CECs) and their progenitors (EPCs) are limited subpopulations of peripheral blood (BP), cord blood (CB), and bone marrow (BM) subpopulations. Such cells are involved in the maintenance of endothelial homeostasis. Both CEC and EPC are believed to be potent biomarkers under various clinical conditions involving endothelial remodeling. To date, several methods have been published for the characterization of CEC and EPC by flow cytometry, but none of them has achieved consistent conclusions; Consequently, the guidelines for clinical use should still be established. Paola Lanuti and colleagues conducted an in-depth study of the CEC and EPC phenotype in healthy PB, CB and BM samples, optimizing a reliable polychromatic flowchart (PFC) cytometry. The results showed that the expression of CD34 on circulating cells in PB and CBs is a key reference point for the identification of CEC (CD45neg / CD34bright / CD146pos) compared to hematopoietic stem cells (CD45dim / CD34pos / CD146neg). This approach, combined with a dual-platform counting technique, allowed a CEC enumeration in healthy BP (n = 38), and consequently counts CEC in line with the previously reported data (median = 11.7 cells / ml). In parallel, using strict PFC settings (selection of CD34pos / CD45dim / CD133pos / VEGFR2pos cells) it was found that the EPC antigen was not found in any sample of PB or CB sound analyzed, since the expression of VEGFR2 is not was detected on the surface of CD34pos / CD45dim / CD133pos cells. Overall, the results suggest that the previously reported EPC antigen profile, defined by the simultaneous expression of VEGFR2 and CD133 on the surface of CD45dim / CD34pos cells, should be carefully reassessed and further studies should be conducted to redefine the EPC characteristics to translate CEC and EPC characterization in clinical practice. The umbilical cord contains on average 60-80 cc of blood and this is where stem cells are found. Recent scientific evidence shows that it is possible to crioconservate the umbilical cord stem cells for at least 24 years without altering their vitality. This implies that cordonic stem cells harvested more than 20 years ago can be effectively transplanted. Because of this, it is more than right to think of the umbilical cord as a precious organ even after 20 years. Umbilical cord stem cells exhibit a peculiar immunological "immaturity" due to low expression on the cell surface of antigens belonging to the higher immune system (MHC I) and the total absence of expression of antigens (and costimulatory molecules) associated with the MHC type II. Thanks to these properties, the allogeneic transplantation of cordonic stem cells is more likely to induce and less risk of rejection. The risk of rejection is also reduced by the presence in the cord blood of regulatory T cells that are capable of preventing or treating inflammatory conditions and modulating immune responses by depressing the activity of self-reactive T lymphocytes. Finally, the umbilical cord stem cells are capable of anti-inflammatory action; can "inflate" inflammatory reactions due to their ability to release several soluble factors such as prostaglandin E2 and interleukin 6.  Umbilical cord stem cell The umbilical cord stem cell population consists of several cell subtypes: (i) similar embryonic stem cells capable of differentiating towards endodermic tissues (e.g., lung), mesodermic (such as the heart) and ectodermic (eg the nervous system ); (ii) mesenchymal cord blood stem cells, which can produce cartilage, adipose, bone, nerve cells and visceral mesoderm; (iii) hematopoietic cord blood stem cells, capable of specializing in bone marrow and blood cells; (iv) endothelial cord blood stem cells, capable of forming blood vessels (1). Mesenchymal Stem Cells (CB-MSCs) are fibroblastoid multipotent cells with a high capacity to self-innovate with high potential for proliferation and differentiation. In vitro, they can undergo numerous replication cycles and are able to originate CFU-F colonies and adhere to plastic surfaces (2). The characterization of the CB-MSCs immunophenotype has allowed identifying (i) the positivity toward superficial markers such as CD105, CD73, CD106, CD54, CD44, CD90, CD29, STRO-1e and (ii) negativity for CD14 markers, CD34, CD45. In addition, CB-MSCs express important molecules and transcription factors such as SMA vimentin, nestin, desmin, Ki-67, Oct-4, NANOG, SSEA-4. In preclinical models, the ability of CB-MSCs to give rise to insulin-producing cells (IPCs) was assessed. A study by Gao et al., Showed that CB-MSCs, when cultured in a medium containing high glucose concentrations, nicotinamide, retinoic acid, exendin-4, and epidermal growth factor, differentiate against IPCs capable of expressing markers typically pancreatic (such as PDX-1, Pax-4, Glut-2 and Ngn-3), and to produce de novo insulin. IPCs derived from CB-MSCs transplanted under the kidney capsule into a murine model have led to an increase in serum insulin levels without, however, improving glycometabolic control. The ability of CB-MSCs to differentiate in bone tissue has been investigated in experimental studies in order to develop new therapeutic protocols in the orthopedic field. Finally, the immunomodulatory activity exerted by CB-MSCs is a potential tool in controlling "host-transplant disease" (GVHD). For this reason, the ability of CB-MSCs to prevent and treat GVHD has been studied in NOD / SCID mice, which have been exposed to GVHD by human infusions of peripheral blood, such as a massive presence of human T lymphocytes in lymph nodes, liver and lungs. The multiple and systemic administration of CB-MSCs in NOD / SCID mice significantly reduced the proliferation of human T cells and tissue damage, thereby improving the survival rate of treated animals. In contrast, no therapeutic effect was detected following CB-MSC infusion at the onset of GVHD. It follows that the clinical use of CB-MSCS is, therefore, a prophylactic treatment in the prevention of GVHD The advantages offered by umbilical cord stem cells  - They can be taken without exposing the donor to any procedural or infectious risk, a condition that manifests itself when collecting bone marrow cells - They have a regenerative potential greater than adult stem cells - They show greater chromosomal stability, that is, they have a DNA less prone to mutations, than adult stem cells - Have less oncogenic potential, ie to form tumors, than adult stem cells - They are immunologically immature cells, which makes them more acceptable by the organism minimizing the onset of post-traumatic pathologies, such as Graft Versus Host Disease (GVHD) - They are cells that can exert anti-inflammatory action - The combination of immunomodulatory and anti-inflammatory capability makes autologous cord blood stem cells a great tool for caring for autoimmune diseases - Their collection and use does not raise any ethical problems, a situation which is related to embryonic stem cells Why keep the umbilical cord stem cells There are several reasons why it is advisable to preserve umbilical cord stem cells. First of all, these cells have already been used as a treatment for various pathologies such as leukemia, lymphoma, anemia (the first stem cell transplant was performed on a patient suffering from Fanconi anemia). In addition, the ongoing advances in scientific research are expanding the range of potential therapeutic application of stem cells extracted from the umbilical cord; for example, clinical trials are in progress to evaluate the efficacy of umbilical cord stem cell transplantation in diabetes care in humans. How does the conservation of cordonic stem cells occur? At birth, cord blood is collected from the umbilical vein and transferred to a suitable collection bag containing an anticoagulant (usually a citrate-phosphate-dextrose solution). After collection, cord blood is subjected to hematological analyzes by evaluating cellularity, volume, bacteria and other parameters. Subsequently, red blood cells and plasma are eliminated, retaining only the fraction of mononuclear cells (ie umbilical cord stem cells). The resulting unit is then mixed with 10% dimethyl sulfoxide and transferred to a cryopreserved sac. Finally, the latter is placed in specially controlled temperature controlled freezers and cryopreserved in nitrogen vapors at -196 ° C. It has been scientifically demonstrated that umbilical cord stem cells can be cryopreserved for up to 24 years without altering proliferation and differentiation ability. Da: http://www.conservazionecellulestaminali.it/Home.aspx